注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴?;ぱ劬怠?/div>
3、称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积。一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶*融化,其间每隔2-3分钟混匀一次;
重要提醒:在凝胶*溶解之后,注意凝胶-BindingBuffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少。观察混合物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5μl浓度为5M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值。经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。一般情况下,使用新鲜的电泳缓冲液,凝胶-Bindingbuffer混合物的PH值的不会升高;
4、转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000×g离心1min,弃去液体。
一个HiBindDNA柱子最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上。但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μgDNA。如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中。
5、将柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键,不要忽略此步。
6、将柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;注:SPWWashbuffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释。
7、将柱子重新套回收集管中,重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;
8、弃去液体,将空柱子重新套回收集管中,10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体。
这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的。
9、把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10,000×g离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度。